Как подбирать праймеры для секвенирования
Список стандартных праймеров для сиквенса
| Название праймера | Сиквенс |
|---|---|
 | |
| M13dirL | GTT GTA AAA CGA CGG CCA GTG |
| M13dirShort | GTA AAA CGA CGG CCA GT |
| M13rev | AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA |
| T7uni (T7dir) | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG |
| T7rev | ATG CTA GTT ATT GCT CAG |
| pQE60dir | ATT GTG AGC GGA TAA CAA TTT C |
| pQE100dir | GCT TTG TGA GCG GAT AAC A |
| pQE70rev | CCG AGC GTT CTG AAC AAA TC |
| Sp6 | GAT TTA GGT GAC ACT ATA GAA TA |
| CMV-up | AGG CGT GTA CGG TGG GAG |
| C1for2 | CCA TTG ACG TCA ATG GGA GTT |
| C1rev2 | CAA GTT AAC AAC AAC AAT TGC AT |
| EGFP-N | CGT CGC CGT CCA GCT CGA CCA G |
| EGFP-C | CAT GGT CCT GCT GGA GTT CGT G |
| pJET-for | CGA CTC ACT ATA GGG AGA GCG GC |
| pJET-rev | AAG AAC ATC GAT TTT CCA TGG CAG |
| T3promoter | GCG CGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG |
| T5promoter | GTG AGC GGA TAA CAA TTT CAC AC |
| pGEX-for | GGG CTG GCA AGC CAC GTT TGG TG |
| pGEX-rev | CCG GGA GCT GCA TGT GTC AGA GG |
| 27F | AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG |
| 1492R | ACG GYT ACC TTG TTA CGA CTT |
| U-19mer primer | GTT TTC CCA GTC ACG ACG T |
| pBAD-for | ATG CCA TAG CA T TTT TAT CC |
| pBAD-rev | GAT TTA ATC TGT ATC AGG CTG |
| PRL-seq | ACA TGT TCT TTC CTG CGT TAT C |
| pET60 dir | GCC AGC AAC CGC ACC TGT G |
| pET85 rev | GCG CTT AAT GCG CCG CTA C |
НЕ ЯВЛЯЕТСЯ ПУБЛИЧНОЙ ОФЕРТОЙ
Информация, представленная на сайте, носит исключительно информационный характер и ни при каких условиях не является публичной офертой, определяемой положениями статьи 437 ГК РФ.
Окончательная цена товара указывается в документе на оплату товара.
Подбор праймеров
Размер праймера должен быть 16-25 нуклеотидов. Меньше 16-ти: слабая связь с целью
Ц+Г должно быть 50-60 %
Проверь сбалансированность PCR по нуклеотидам и праймерам Расчёт параметров ПЦР
Отсутствие внутренней вторичной структуры (праймеры не должны быть само- и взаимнокомплиментарными)
Отсутствие комплементарности между 3′-концами (чтобы не образовывалось праймер-димеров)
Упрощенный расчет оптимальной температуры отжига праймера:
Tm = [(A+T) x 2 °C] + [(G+C) x 4 °C](если суммарная длина олигонуклеотида не превышает 20 оснований)
Tm = 22 + 1.46([2 x (G+C)] + (A+T))(если суммарная длина олигонуклеотида составляет 20-30 оснований)
Секвенирование биополимеров(белков и нуклеиновых кислот — ДНК и РНК) — определение их первичной аминокислотной илинуклеотидной последовательности (от англ. Sequence — последовательность). В результате получается линейное символьное описание, которое сжато резюмирует атомную структуру молекулы.
Для секвенирования применяются методы Эдмана, Сенгера и другие; в настоящее время для секвенирования нуклеиновых кислот обычно применяется метод Сенгера с дидезоксинуклеозидтрифосфатами (ddNTP). Обычно до начала секвенирования производят амплификацию участка ДНК, последовательность которого требуется определить при помощи ПЦР.
Дезоксинуклеотидный метод, или метод «обрыва цепи», был разработан Ф. Сенгером в 1977 году и в настоящее время широко используется для определения нуклеотидной последовательности ДНК. При дидезокси-секвенировании происходит гибридизация синтетического олигонуклеотида длиной 17—20 звеньев со специфическим участком одной из цепей секвенируемого участка. Этот олигонуклеотид является праймером, поставляющим 3′-гидроксильную группу для инициации синтеза цепи, комплементарной матрице
Раствор с праймером распределяют по четырем пробиркам, в каждой из которых находятся четыре дезоксинуклеотида, dATP, dCTP, dGTP и dTTP (один из них — меченный радиоактивным изотопом) и один из четырех 2′,3′-дидезоксинуклеотидов (ddATP, ddTTP, ddGTP или ddCTP). Дидезоксинуклеотид включается по всем позициям в смеси растущих цепей, и после его присоединения рост цепи сразу останавливается. В результате этого в каждой из четырех пробирок при участии ДНК-полимеразы образуется уникальный набор олигонуклеотидов разной длины, включающих праймерную последовательность. Далее в пробирки добавляют формамид для расхождения цепей и проводят электрофорез в полиакриламидном геле на четырех дорожках. Проводят радиоавтографию, которая позволяет «прочесть» нуклеотидную последовательность секвенируемого сегмента ДНК.
В более современном варианте дидезоксинуклеотиды метят четырьмя разными флуоресцентными красителями и проводят ПЦР в одной пробирке. Затем во время электрофореза в полиакриламидном геле луч лазера в определенном месте геля возбуждает флуоресценцию красителей, и детектор определяет, какой нуклеотид в настоящий момент мигрирует через гель. Современные приборы используют для секвенирования ДНК капиллярный электрофорез.
Бромистый этидий, EtBr
Спектр поглощения бромистого этидия
Бромистый этидий (3,8-Диамино-5-этил-6-фенилфенантридиум бромид, EtBr, Ethidium bromide) — интеркалирующий агент, широко применяемый для выявления нуклеиновых кислот вмолекулярной биологии, в частности, в случае ДНК электрофореза в агарозном геле.
При освещении ультрафиолетовым светом, EtBr флюоресцирует оранжевым цветом, интенсивность флюоресценции увеличивается примерно в 20 раз при связывании с ДНК.
Под названием Homidium, бромистый этидий использовался для лечения Трипаносомоза у рогатого скота в 1950х годах.
Из-за возможности связывания с ДНК, и при освещении ультрафиолетом, стимулирования разрывов в ДНК, бромистый этидий может быть сильным мутагеном. Также считается канцерогеном и тератогеном, хотя эти свойства никогда не были тщательно исследованы.
Фотография агарозного геля после ДНК-электрофореза.
Результат электрофоретического разделения продуктов ПЦР-реакции. Агарозный гель окрашен бромистым этидием. Визуализация посредством облучения ультрафиолетом с длинной волны 312нм.
Электрофорез ДНК — это аналитический метод, применяемый для разделения фрагментов ДНК по размеру (длине). Силы электрического поля, прикладываемого к образцам, заставляют фрагменты ДНК мигрировать через гель. Сахарофосфатный остов молекул ДНК заряжен отрицательно и поэтому цепи ДНК двигаются от катода, заряженного отрицательно, к положительному аноду. Более длинные молекулы мигрируют медленнее, так как задерживаются в геле, более короткие молекулы двигаются быстрее.
После разделения (иногда краситель вносят в расплавленную агарозу) фрагменты ДНК разной длины визуализируют при помощи флюоресцентных красителей, специфично взаимодействующих с ДНК, например, агарозные гели обычно красят бромистым этидием, который интеркалирует между азотистыми основаниями дуплекса и флюоресцирует в УФ-лучах.
Определение размеров производят путем сравнения коммерчески доступных фрагментов ДНК (DNA ladder, «линейка»), содержащий линейные фрагменты ДНК известной длины.
Для ДНК электрофорезов обычно используют агарозные (для относительно длинных молекул ДНК) иполиакриламидные (для высокого разрешения коротких молекул ДНК, например, в случаесеквенирования) гели.
, ПЦР в реальном времени, количественный ПЦР.
В молекулярной биологии, ПЦР в реальном времени (или количественный ПЦР) — лабораторный метод, основанный на методе ПЦР, используется для одновременной амплификации и измерения количества заданной молекулы ДНК. Метод ПЦР в реальном времени включает в себя одновременно детекцию и количественное определение (измерение непосредственно количества копий, либо измерение копий относительно внесенной ДНК или дополнительных калибровочных генов) специфической последовательности ДНК в образце.
Метод в общем использует общие принципы ПЦР, основное отличие состоит в том, что измеряется количество амплифицированной ДНК в реальном времени после каждого цикла амплификации. Для количественного определения используют два метода —флюоресцентные красители, интеркалирующие в двуцепочечные молекулы ДНК и модифицированные дезокси-нуклеотиды, которые флюоресцируют после гибридизации с комплементарными участками ДНК.
Часто ПЦР в реальном времени комбинируют с ОТ-ПЦР (обратная транскрипция) для измерения малых количеств мРНК, что позволяет исследователю получать количественную информацию о содержании данной мРНК в клетке и, соответственно, позволяет судить об уровне экспрессии данного гена в отдельной клетке или ткани.
Дата добавления: 2015-04-05 ; просмотров: 111 ; Нарушение авторских прав
Пошаговое руководство по разработке праймеров для qPCR
Разработка праймеров для qPCR — важный шаг при постановке анализа qPCR или обратной транскрипции-qPCR (RT-qPCR). Праймеры qPCR, которые плохо отжигаются или отжигаются более чем к одной последовательности во время амплификации, могут значительно повлиять на качество и надежность результатов.
Кроме того, если вы проводите одностадийную RT-qPCR, обратная транскриптаза будет использовать обратный праймер для запуска реакции транскрипции. В этом случае некачественный праймер приведет как к неэффективной обратной транскрипции, так и к неэффективной амплификации — проигрышная ситуация.
Учитывая вышесказанное, стоит потратить время, необходимое для разработки качественных праймеров для qPCR. В этой статье мы расскажем вам, как именно это сделать!
Хорошая новость заключается в том, что праймеры дешевы, поэтому вы можете легко протестировать несколько различных пар, чтобы выбрать лучшие для вашего эксперимента.
Плохая новость: тестирование праймеров требует времени и терпения, поэтому чем быстрее вы получите пару работающих праймеров, тем лучше.
Инструмент NCBI Primer-BLAST широко используется для дизайна праймеров для qPCR. В Интернете доступно множество других инструментов для проектирования праймеров, включая primer3, а поставщики ПЦР часто предлагают свои собственные бесплатные программы для проектирования.
Ниже описаны основные этапы проектирования праймеров для qPCR с использованием инструмента NCBI Primer-BLAST.
Этапы проектирования будут аналогичными, если вы используете другие программы проектирования праймеров, и приведенная ниже информация должна дать вам представление о параметрах, на которые следует обратить внимание.
Дизайн праймеров для qPCR: Начало работы
Зайдите в базу данных генов Pubmed и выполните поиск интересующего вас гена. В правом углу следующего экрана вы можете отфильтровать по видам.
Нажмите на интересующий вас ген и прокрутите страницу вниз, пока не найдете NCBI Reference Sequence (RefSeq) для вашего гена (например, «NM_203483»).
Нажмите здесь, и на следующем экране в правом углу экрана вы увидите ссылку «Pick primers».
Параметры праймеров для qPCR
Установите следующие параметры праймеров:
Размер продукта ПЦР/ампликона: Для эффективной амплификации подберите праймеры таким образом, чтобы длина ампликона составляла от 70 до 200 п.н.
Количество праймеров для возврата: Это зависит от вас, в зависимости от того, сколько вариантов вы хотите выбрать. Программе не потребуется много времени, чтобы разработать 10 пар праймеров, и это должно дать вам разумный шанс найти подходящую пару.
Температура плавления: Как правило, следует стремиться к минимальной температуре 60°C и максимальной 63°C; идеальная температура плавления составляет 60°C (с максимальной разницей в 3°C в температурах плавления, Tm, двух праймеров). Для определения этих температур можно использовать калькулятор Tm.
Выбор экзона/интрона
Чтобы избежать амплификации загрязняющей геномной ДНК, подберите праймеры таким образом, чтобы одна половина праймера гибридизовалась с 3′-концом одного экзона, а другая половина — с 5′-концом соседнего экзона.
Для этого просто выберите «Праймер должен охватывать стык экзона и экзона». Другие параметры изменять не нужно.
Параметры проверки специфичности пары праймеров: Используйте настройки по умолчанию. Программа будет использовать последовательность RefSeq мРНК выбранного вами организма для конструирования праймеров.
Проверка экрана вывода
Посмотрите на параметры, которые выдала программа, и обратите особое внимание на следующее:
Убедитесь, что 3′-конец праймера содержит остаток C или G, поскольку остатки T и A легче связываются с ДНК неспецифическим образом.
Стремитесь к содержанию GC около 40-60% для обеспечения максимальной стабильности продукта.
Избегайте самокомплементарности, чтобы снизить вероятность образования праймер-димеров. В идеале праймер должен иметь почти случайный набор нуклеотидов.
Теперь выберите два-три лучших праймера и протестируйте их. Удачи!
Если у вас есть другие лучшие советы по разработке праймеров для qPCR, мы будем рады услышать вас в комментариях!
Разница между праймерами для ПЦР и праймерами для секвенирования
С последними достижениями в области молекулярной биологии были разработаны различные генетические методы, которые сделали процессы исследования различных направлений предмета легкими и точными. ПЦР и
Содержание:
Что такое праймеры для ПЦР?
Содержание гуанина и цитозина (GC) в хорошем праймере должно быть в пределах 40-60. Температура отжига праймера и температура плавления являются важными факторами во время ПЦР. Температура плавления должна быть рассчитана точно, а температура отжига праймера должна быть 5 ° С. 0 C ниже температуры плавления. Температура плавления должна составлять 60 ° C и 75 ° C. Слишком высокая или слишком низкая температура приведет к снижению активности ДНК-полимеразы.
Что такое праймеры для секвенирования?
Праймеры для секвенирования используются в контексте секвенирования фрагмента ДНК с целью выявления его специфической идентичности. Для получения хороших результатов секвенирования важны праймеры и шаблоны высокого качества. Таким образом, при выборе праймеров они должны быть уникальными для конкретной области, в которой мы хотим секвенировать. Он также должен быть с правильной ориентацией, когда последовательности обычно образуются от 3 ’до 5’ концов праймеров. В последовательности не должно быть нежелательной самогибридизации, такой как образование шпилечных петель. Он не должен содержать последовательного образования гуаниновых оснований.
Температура плавления (Tm) праймера должна соответствовать условиям секвенирования. Следовательно, он должен находиться в пределах 52 о C и 74 о C. Подготовка олигонуклеотидов для использования в качестве праймера должна быть очищена для получения желаемой полной длины последовательности. Если олигонуклеотиды содержат примеси, передача сигналов последовательности праймера будет наложена с разных сайтов праймирования, и это также уменьшит количество основных клеток.
Температура плавления праймера (Tm) олигонуклеотида определяет, насколько сильно комплементарные цепи ДНК гибридизуются друг с другом. Tm можно рассматривать как термодинамический расчет, где он зависит как от последовательностей ДНК, так и от нескольких условий, таких как концентрация соли. Tm важен во время ПЦР, где для получения группы фрагментов с дидезоксинуклеотидным окончанием используется вариант, называемый циклическим секвенированием. Здесь праймер, который секвенирован, сначала будет альтернативно отожжен, затем удлинен и, наконец, денатурирован для амплификации. Следовательно, значение Tm должно быть в пределах 52 о C и 74 о C. Синтезированные олигонуклеотиды могут быть получены в лабораториях синтеза ДНК / РНК по выбору. Небольшой масштаб синтеза, который используется для секвенирования ДНК, обычно составляет 50 нмоль. Также, что наиболее важно, праймеры, используемые для секвенирования, должны быть очищены от примесей, которые предотвратят снижение качества.
Каковы сходства между праймерами для ПЦР и праймерами для секвенирования?
В чем разница между праймерами для ПЦР и праймерами для секвенирования?
Праймеры для ПЦР и праймеры для секвенирования
Праймеры для секвенирования используются в контексте секвенирования фрагмента ДНК с целью выявления его специфической идентичности. Для запуска процесса будет достаточно одного праймера для секвенирования. Для получения хороших результатов секвенирования важны высококачественные праймеры и матрицы. Таким образом, при выборе праймеров они должны быть уникальными для конкретной области, в которой мы хотим секвенировать. Праймеры для ПЦР представляют собой короткие цепи ДНК с длиной нуклеотидов 18-25, которые совместимы с начальной и конечной областями фрагментов ДНК, которые должны быть амплифицированы. Праймеры для ПЦР могут быть прямым праймером и обратным праймером. Содержание гуанина и цитозина (GC) в хорошем праймере должно быть в пределах 40-60. Температура отжига праймера и температура плавления являются важными аспектами во время ПЦР. В этом разница между праймерами для ПЦР и праймерами для секвенирования.
Четыре бесплатных и простых онлайн-инструмента для разработки ПЦР праймеров
Проектирование и проведение реакций ПЦР в лаборатории стало настолько распространенным явлением, что количество доступных инструментов конструирования праймеров может быть немного подавляющим для новичка (или даже опытного молекулярного биолога!). Ниже приведены четыре онлайн-программы, которые помогут быстро, легко и эффективно разработать дизайн праймеров.
1. IDT OligoAnalyzer: Это простой, но эффективный инструмент для определения физических свойств олиго-последовательностей до 255 оснований. После загрузки последовательности вы получите информацию о ее длине, содержании GC (ГЦ), диапазоне температур плавления, молекулярной массе, коэффициенте экстинкции и оптической плотности. Особенно интересны вкладки формирования структуры шпильки, а последняя версия также позволяет пользователям легко выполнять NCBI Blast без копирования и вставки последовательности.
Проверьте праймер без каких-либо добавленных сайтов рестрикции для клонирования, прежде чем заказывать свой праймер. Поскольку добавленный сайт не связывается с ДНК-шаблоном в первом раунде амплификации, вы должны убедиться, что свойства праймера не меняются значительно и не тормозят реакцию!
2. PrimerBlast от NCBI (Primer3): возможно, один из наиболее уважаемых и универсальных онлайн-инструментов для разработки и анализа праймеров. PrimerBlast был разработан NCBI и сочетает в себе проверенную платформу Primer3 с возможностями Blast. Последний компонент имеет решающее значение, если вы амплифицируете геном организма и хотите минимизировать неспецифическое связывание с генами, сходными с вашей последовательностью-мишенью в геноме.
Для начала вы можете скопировать / вставить шаблон в PrimerBlast или использовать номер доступа в базе данных NCBI. Затем решите, какой из множества параметров вы хотите указать, например приемлемую длину продукта, диапазон температур плавления и выбор экзона / интрона, если вы разрабатываете праймеры для амплификации мРНК (экзоны делятся на некодирующие интроны в кодирующей ДНК). для мРНК).
После отправки и анализа последовательности вы также можете отсортировать результаты по длине праймера, температуре плавления и т. д. Моя любимая часть использования PrimerBlast — это то, что он предоставляет визуальный интерфейс, включая то, где праймеры будут связываться с шаблоном.
3. BatchPrimer3: это отличный инструмент для создания праймера с более высокой пропускной способностью. BatchPrimer3 основан на Primer3 и может создавать широкий спектр праймеров. Результаты предоставляются в виде HTML с визуализацией выравнивания с цветовой кодировкой и могут быть загружены в форме с разделителями табуляции. С помощью этого инструмента вы также можете получить пакетную информацию о физических параметрах предлагаемых праймеров.
4. HYDEN (HighlY DegeNerate primer) : иногда вы не знаете точную последовательность ДНК-мишени, которую вы пытаетесь амплифицировать, например, когда вы работаете с ДНК организма, которая еще не была секвенирована. В этом случае вы можете разработать «вырожденные» праймеры на основе родственных организмов или реверсировать их с помощью аминокислотной последовательности. HYDEN — это загружаемая программа, основанная на командной строке, которая разрабатывает праймеры для многих входных последовательностей.
Конечно, этот список не является исчерпывающим — есть много других доступных вариантов онлайн! Перед тем, как подключать все ваши любимые шаблоны убедитесь, что у вас есть подробное понимание того, как работает ПЦР и ваше конкретное приложение, прежде чем разрабатывать и заказывать учебники для начинающих. Хотя оптимальная конструкция праймера может иметь большое значение для успеха в термоциклере, рассмотрите возможность изменения других ключевых компонентов вашей реакции ПЦР (таких как температура отжига, концентрация магния и используемая полимераза), чтобы еще больше увеличить ваши шансы на успех с особенно трудными шаблонами.
Какие инструменты вы используете для разработки учебника для начинающих и что вам в них нравится? Расскажите нам в комментариях ниже!